細(xì)菌脂肪酸的提取與分析

發(fā)布時(shí)間：

2018-09-10

概要：

取50 mg凍千細(xì)胞加入6 mol/1 HC1-CH3OH溶液2 m1，置100°C的條件下鹽酸水解甲基化3 h，溶液呈現(xiàn)棕褐色(或黑褐色)，取出，置室溫下冷卻。加入正己烷1.5m1振蕩。經(jīng)4000 r / min離心10min，收集上清液再加入正已烷1.5m1 .抽提一次，合并兩次.上清液，加入蒸餾水3ml，經(jīng)4000r/ min離心10 min,收集上清液于離心管中。

試劑: 0.3%甲醛、6 mo1/1 HC1-CH3OH溶液、三氯甲烷方法: GC- -MS 聯(lián)用分析測(cè)定，步驟如”下:
(1)菌體的培養(yǎng)與收集

I組實(shí)驗(yàn)菌株用YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加一定量的抗凍保護(hù)劑，接種后放入30°C、150 r/ min的搖床中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞振蕩培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)中期，移取適量細(xì)胞懸浮液至-30°C冰箱冷凍7d，取出30°C 下解凍5-10min,用0.3%甲醛滅活后， 4000r / min下離心5 min, 棄去上清液，用蒸餾水洗滌，離心收集細(xì)胞，-18C冷凍，冷凍真空干燥制得千細(xì)胞后備用。

空白樣用0.3%甲醛滅活后， 4000 r/ min下離心5 min,棄去上清液，用蒸餾水洗滌，離心收集細(xì)胞，-18C冷凍 24h，冷凍真空千燥制得千細(xì)胞后備用。

II組實(shí)驗(yàn)菌株用于面包冷凍面團(tuán)的制備，添加抗凍保護(hù)劑，于-20C冷凍30d后取出解凍，取20g解凍后的面團(tuán)，分散于180ml 無菌水中，震蕩30min, 靜置15min，離心并取上清液。用0.3%甲醛滅活后， 4000r / min下離心15 min, 棄去上清液，用蒸餾水洗滌，離心收集細(xì)胞，-18C冷凍，冷凍真空干燥制得干細(xì)胞后備用。空白樣則不添加抗凍保護(hù)劑，其余處理方法-樣。

(2) 脂肪酸的甲基化與提取

取50 mg凍千細(xì)胞加入6 mol/1 HC1-CH3OH溶液2 m1，置100°C的條件下鹽酸水解甲基化3 h，溶液呈現(xiàn)棕褐色(或黑褐色)，取出，置室溫下冷卻。加入正己烷1.5m1振蕩。經(jīng)4000 r / min離心10min，收集上清液再加入正已烷1.5m1 .抽提一次，合并兩次.上清液，加入蒸餾水3ml，經(jīng)4000r/ min離心10 min,收集上清液于離心管中。用流動(dòng)N2吹千，加入10μ1三氯甲烷制備脂肪酸酯化液。

(3)薄層層析

用玻璃毛細(xì)管取脂肪酸酯化液點(diǎn)在硅膠G-TLC薄層板上，以正已烷+無水乙醚(1+1)為展層系統(tǒng)，待層析液至硅膠板上緣后立即取出薄層板，風(fēng)干。在UV254燈下檢查制備的脂肪酸純度與相對(duì)濃度。將脂肪酸甲酯帶做好標(biāo)記，輕輕刮下，用二乙醚抽提兩次，經(jīng)N吹千后加入0. 5ml無水甲醇振蕩溶解，然后進(jìn)行GC一MS分析。
(4)GC--MS操作條件

程序升溫:初溫130°C，保持1 min; 終溫280°C，維持min,升溫速度7.6°C / min。檢測(cè)器溫度250°C;載氣(He)流速30ml / min; 分流比50: 1;流速(He)49. 9ml / min;進(jìn)樣量1μl。 (2)中質(zhì)譜條280°C，質(zhì)量掃描范圍35-500。

關(guān)鍵詞：